多色流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選是研究肝巨噬細(xì)胞（hepatic m?）的強(qiáng)大免疫學(xué)工具，但對(duì)于制備肝勻漿以進(jìn)行這些分析的方法尚無共識(shí)。利用巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞報(bào)告小鼠的組合、流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦成像，我們已經(jīng)表明，用于識(shí)別庫普弗細(xì)胞（Kupffer cells, KCs）的常規(guī)流式細(xì)胞策略會(huì)包括相當(dāng)比例的CD31高表達(dá)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）。無論為流式細(xì)胞術(shù)制備細(xì)胞的方法如何，這些內(nèi)皮細(xì)胞均存在，并且代表緊密附著在KC膜殘余上的內(nèi)皮。針對(duì)內(nèi)皮標(biāo)志物（如CD31）的抗體對(duì)于排除這些細(xì)胞至關(guān)重要。這一結(jié)果將人們的注意力集中在最近發(fā)布的微陣列數(shù)據(jù)集中，這些數(shù)據(jù)集顯示與其他組織駐留巨噬細(xì)胞相比，KCs高表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的基因。我們的研究還揭示了常用分離方法中KCs在白細(xì)胞中顯著且特異性的丟失，這些方法導(dǎo)致增殖性和單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞被富集。因此，我們提出了一種方法，可以高產(chǎn)率地獲得肝髓系細(xì)胞，而不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞類型偏倚或被內(nèi)皮細(xì)胞污染。消除內(nèi)皮細(xì)胞污染及傳統(tǒng)肝庫普弗細(xì)胞分離和分析方法中固有的選擇偏倚的實(shí)驗(yàn)方案。

愛丁堡大學(xué)Stephen Jenkins團(tuán)隊(duì)用Cdh5-CreERT2 × mTmG報(bào)告小鼠。 他們發(fā)現(xiàn)：在肝組織流式分析中，肝臟KF細(xì)胞經(jīng)典的“F4/80高、CD11b低"設(shè)門群體中，有10%左右的細(xì)胞是CD31高表達(dá)的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）。這些細(xì)胞看似巨噬細(xì)胞，卻在顯微鏡下露出真面目—— CD45?F4/80?CD31?的“雙陽"細(xì)胞，實(shí)為Kupffer細(xì)胞殘膜緊貼在內(nèi)皮表面形成的粘連體（doublets）！

肝臟灌注，酶消化裂解。常用的分離方法是Percoll密度梯度離心法。無論那種方法，包括300g雙離心法和50g慢速預(yù)離心法，都能在KCs群中看到“偽Kupffer細(xì)胞"——即CD31?污染。 而且，Percoll法雖然被廣泛使用，卻帶來了相對(duì)更嚴(yán)重的細(xì)胞丟失和比例偏倚。Percoll法獲得的Kupffer細(xì)胞數(shù)比300g法少7倍以上；Ki67陽性比例、骨髓嵌合結(jié)果均被高估。因此，建議排除CD31?污染。肝臟庫弗巨噬細(xì)胞流式檢測(cè)受到內(nèi)皮細(xì)胞干擾F4/80和CD31雙陽。